目前引物合成基本采用固相亞磷酰胺y三酯法。該方法具有高效、快速的偶聯(lián)以及起始反應(yīng)物比較穩(wěn)定的特點。主要是將dna固定在固相載體上完成dna鏈的合成，由待合成引物的3'端向5'端合成延伸，相鄰的核苷酸通過3'→5'磷酸二酯鍵連接。
1. 固相亞磷酰胺三酯法合成引物的具體步驟如下：
1) 用三***去除固相載體5'-羥基的保護基團dmt，獲得游離的5'-羥基；
2) 將亞磷酰胺保護核苷酸單體與活化劑四氮唑混合，得到核苷亞磷酸活化中間體，與游離的5'-羥基發(fā)生縮合反應(yīng)；
3) 由于無法保證5'-羥基都參與縮合，可能有極少數(shù)5'-羥基沒有參加反應(yīng)(少于2%)，可用乙酸酐和1-甲基咪唑試劑將其終止合成，這種短片段可以在純化時分離掉；
4) 在氧化劑的作用下，亞磷酰形式轉(zhuǎn)變?yōu)楦€(wěn)定的磷酸三酯，使dna磷酸骨架更穩(wěn)定。
經(jīng)過以上四個步驟，一個脫氧核苷酸就被連接到固相載體上。重復以上步驟，直到所有要求合成的堿基連接完成。合成過程中可以監(jiān)控脫下的保護基團dmt的顏色可以初步判定合成效率。
2. dna合成粗產(chǎn)物中含有什么雜質(zhì)？
主要是合成過程中產(chǎn)生的少量失敗片段。
3. 引物純化方式有哪些？
目前引物常用的純化方式有：c18脫鹽、rpc純化、epage純化、page純化、hplc純化。
表1. 引物純化主要方式的介紹
4. 引物純化方式如何選擇？ 一般采用rpc、epage純化、page、hplc四種純化方式，在選擇上主要根據(jù)引物的長度和應(yīng)用方面對純度的要求而定，表2即從引物長度的角度總結(jié)了以上每一種純化方法的適用范圍?？筛鶕?jù)實驗需要，選擇合適的引物純化方式。
表2. 引物純化主要方式的適用范圍及建議
5. 合成的引物5'端是否有磷酸化？ 合成的引物5'端為羥基，沒有磷酸基團。如果需要，可以用多核苷酸激酶進行5'端磷酸化，或者合成時直接在5'或3'端進行磷酸化。
6. 最長可以合成多長的引物？ 引物越長，出現(xiàn)問題的概率就越大。除非有特殊需要，我們建議合成片段長度不要超過80mer,按照目前的引物合成效率，80mer的粗產(chǎn)品，全長引物的百分比不會超過40%，后續(xù)處理還會丟失很多，因此最后的產(chǎn)量很低。
7. 為何長鏈引物的收費要比短鏈引物要高？ 在合成長鏈引物時，所需要的試劑比短鏈引物要多，回收值也相對低一些，尤其是長度大于90base的引物。由于成本的增加，從而導致價格升高。
8. pcr產(chǎn)物經(jīng)過克隆以后測序發(fā)現(xiàn)引物區(qū)與合成序列不相符合，怎么辦？ 多數(shù)情況是pcr過程和克隆過程中引入的錯誤。遇到這種情況，可以：
1) 重新挑取克隆測序，會有找到正確克隆的可能。
2) 重新合成引物。
9. 測序發(fā)現(xiàn)引物有突變是怎么回事？ 引物合成是一種多步驟的化學反應(yīng)，每一步的合成效率高也就是99%，副產(chǎn)品不可以避免。鏈越長，突變的頻率累加起來就越高。在pcr擴增后克隆測序的時候，為了節(jié)約時間和提高成功率，建議：
1)在檢測到陽性克隆后準備2~3個陽性克隆子的菌液，盡量送測2個或以上克隆，這樣成功率將大大提高，也節(jié)約很多時間；
2)也可以先送測1個克隆，其余兩個克隆子的菌液在冰箱4度保存，一旦出現(xiàn)個別點突變或缺失，立即將余下的兩個克隆送測；
3）這樣得到正確的序列可能性將非常高，并且可以免去重新pcr、連接、克隆以及篩選的一系列實驗操作，更省去了很多時間。