由于二代測(cè)序讀長(zhǎng)的限制，不可能一下將一個(gè)很長(zhǎng)的基因序列測(cè)通，因此需要先將長(zhǎng)基因序列隨機(jī)片段化成小片段，這樣的話，這些片段就可以覆蓋整個(gè)基因組。所以需要構(gòu)建文庫(kù)。
一、文庫(kù)構(gòu)建的步驟
文庫(kù)構(gòu)建大致步驟類似，但是各有各自du特的點(diǎn)，例如，rnaseq里mirna，lncrna，mrna方法各有差異，具體方法以后有機(jī)會(huì)再補(bǔ)充。這里以illumina的 pe文庫(kù)為例，其流程圖如下圖。
二、文庫(kù)構(gòu)建詳細(xì)步驟
（1）dna片段化 （fragment dna）
使用超聲、酶或者加熱的方式將dna樣品打碎成小片段，一般在300 ~ 800bp之間除非有特殊要求。
（2）末端修復(fù)（end repair）
補(bǔ)平片段化時(shí)導(dǎo)致的不平末端。
（3）3' 末端加“a” （a-tailing）
3‘ 末端加a，轉(zhuǎn)換為粘性末端，與adapter 互補(bǔ)配對(duì)，因?yàn)閍dapter 3‘端有一個(gè)突出的t。
（4）接頭連接（ ligation adaptor）
這一步有兩種不同的添加策略如下圖。
左邊的圖是直接在fragment dna的兩端直接加上full y-adapter, adapter中已經(jīng)包括了和p5/p7 oligo互補(bǔ)的序列, index, 以及read1/read2的測(cè)序引物。
右邊的圖是先在fragment dna的兩端加上pe adapter, 然后再引入和p5/p7 oligo互補(bǔ)配對(duì)的序列以及index序列，分兩步：
a.pe adapter添加利用堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則，加上pe adapter。pe adpater中一部分是建庫(kù)pcr富集時(shí)候需要用的引物序列，另一部分是測(cè)序時(shí)需要用的引物。
b.pcr 添加 index，p5，p7
index也稱barcode，用來(lái)區(qū)分不同樣本的文庫(kù)，因?yàn)闇y(cè)序儀一個(gè)lane產(chǎn)生數(shù)據(jù)量若干gb，為了最da化利用測(cè)序儀，一次上機(jī)常會(huì)進(jìn)行多個(gè)樣本文庫(kù)混合測(cè)序，在后續(xù)分析時(shí)，index用來(lái)區(qū)分?jǐn)?shù)據(jù)是來(lái)自哪個(gè)樣本。
●pcr富集目的片段
進(jìn)行pcr擴(kuò)增，循環(huán)數(shù)與投入的dna量有關(guān)，使得文庫(kù)達(dá)到上機(jī)濃度。
●擴(kuò)增文庫(kù)大小質(zhì)檢
使用agilent 2100對(duì)文庫(kù)的insert size進(jìn)行檢測(cè)。
●文庫(kù)濃度定量
qubit3.0 進(jìn)行初步定量 q-pcr對(duì)文庫(kù)的有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量，至此文庫(kù)構(gòu)建結(jié)束。
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