中華人民共和國國家標準
gb 5009.288-2023
食品安全國家標準食品中胭脂蟲紅的測定
1范圍
本標準規(guī)定了食品中胭脂蟲紅的液相色譜測定方法。
本標準適用于食品中胭脂蟲紅的測定。
2原理
試樣中的胭脂蟲紅，經(jīng)鹽酸溶液提取，固相萃取柱凈化后，反相c18液相色譜柱分離，紫外可見光檢測器檢測，外標法定量。
3試劑和材料
除非另有說明，本方法所用試劑均為分析純，水為gb/t 6682規(guī)定的一級水。
3.1試劑
3.1.1甲醇(ch3oh)：色譜純。
3.1.2乙腈(ch3cn)：色譜純。
3.1.3鹽酸(hcl)。
3.1.4磷酸(h3po4)。
3.2試劑配制
3.2.1鹽酸溶液(2.0 mol/l)：量取168 ml鹽酸至盛有800 ml水的1 000 ml容量瓶中，充分混勻后，冷卻至室溫，用水定容至刻度。
3.2.2磷酸甲醇溶液(2%)：量取20 ml磷酸至盛有800 ml甲醇的1 000 ml容量瓶中，充分混勻后，冷卻至室溫，用甲醇定容至刻度。
3.2.3磷酸水溶液(0.1%)：吸取1.0 ml磷酸至盛有800 ml水的1000 ml容量瓶中，充分混勻后，冷卻至室溫，用水定容至刻度。
3.2.4磷酸乙腈溶液(0.1%)：吸取1.0 ml磷酸至盛有800 ml乙腈的1 0000 ml容量瓶中，充分混勻后，冷卻至室溫，用乙腈定容至刻度。
3..3標準品
胭脂紅酸標準品(c22h20o13，cas號：1260-17-9)：純度≥95.5%，或經(jīng)國家認證并授予標準物質(zhì)證書的標準品。
3.4標準溶液配制
3.4.1胭脂紅酸標準儲備液(1.00 mg/ ml)：準確稱取100.0 mg(精確至0.1 mg)標準品，用水溶解，并定容至100 ml容量瓶中，搖勻，于4℃下避光保存，有效期3個月。
3.4.2胭脂紅酸標準系列工作液：用移液管(精確至0.01 ml)準確吸取標準儲備液(1.00 mg/ ml)
0.5 ml于100 ml容量瓶中；分別準確吸取標準儲備液(1.00 mg/ml)0.1 ml、0.2 ml、0.5 ml和1.0 ml于10.0 ml容量瓶中，用磷酸水溶液(0.1%)定容至刻度，搖勻，配制成質(zhì)量濃度分別為5.00 mg/l、10.0 mg/l、20.0 mg/l、50.0 mg/l和100 mg/l胭脂紅酸標準系列工作液。臨用現(xiàn)配。
3.5材料
固相萃取柱(150mg/6ml，混合型強陰離子交換反相柱，填料為含親水基團的聚苯乙烯/二乙烯基苯共聚物上鍵合季銨基團，或相當者)。
4儀器和設(shè)備
4.1高效液相色譜儀：帶紫外可見光檢測器。
4.2天平：感量分別為0.1 mg和1 mg。
4.3恒溫水浴鍋。
4.4渦旋混合器。
4.5超聲波發(fā)生器。
4.6高速離心機。
4.7固相萃取裝置。
4.8氮吹儀。
4.9粉碎機。
5分析步驟
5.1試樣制備
液態(tài)樣品搖勻待提??；基質(zhì)均勻的半固態(tài)樣品和粉狀樣品直接待提?。黄渌麡悠沸鑴驖{或粉碎均勻待提取。制備好的試樣于0℃~5℃保存，盡快測定。
5.2試樣提取
5.2.1液體、半固體試樣(含乳半固體除外)
稱取2 g(精確至0.001 g)試樣于50 ml離心管中，加入鹽酸溶液(2.0 mol/l)40 ml，旋緊蓋子，搖勻，置于沸水浴中加熱30 min，取出冷卻至室溫后，振蕩5 min，超聲5min，5000 r/min離心5 min，上清液轉(zhuǎn)移至50.0ml容量瓶中，用水定容至刻度，經(jīng)適量脫脂棉過濾，待凈化。
5.2.2固體、含乳半固體試樣(調(diào)制乳粉除外)
稱取2 g(精確至0.001 g)試樣于50 ml離心管中，加入鹽酸溶液(2.0 mol/l)40 ml，旋緊蓋子，搖勻，置于沸水浴中加熱30 min，取出冷卻至室溫后，振蕩5 min，超聲5min，5 000 r/min離心5 min，上清液轉(zhuǎn)移至100 ml容量瓶中，殘渣加入鹽酸溶液(2.0 mol/l)40 ml，常溫條件下，重復(fù)提取1次，合并2次提取液，用水定容至刻度，經(jīng)適量脫脂棉過濾，待凈化。
5.2.3調(diào)制乳粉
稱取2 g(精確至0.001 g)試樣于50 ml離心管中，加入鹽酸溶液(2.0 mol/l)40 ml，旋緊蓋子，搖勻，置于沸水浴中加熱30min，取出冷卻至室溫后，振蕩5min，超聲5min，5000r/min離心5min，上清液轉(zhuǎn)移至250 ml容量瓶中，殘渣加入鹽酸溶液(2.0 mol/l)40 ml，常溫條件下，重復(fù)提取2次，合并3次提取液，用水定容至刻度，經(jīng)適量脫脂棉過濾，待凈化。
5.3試樣凈化
固相萃取柱使用前依次用6ml甲醇、6ml水進行活化，保持柱體濕潤，取過濾液25.0ml通過活化后的固相萃取柱(150 mg/6 ml)，依次用12 ml水和6 ml甲醇淋洗，棄去淋洗液，真空抽至柱體近干，用磷酸甲醇溶液(2%)6 ml進行洗脫，收集洗脫液，于40℃水浴下氮吹濃縮至近干，加入2.00 ml磷酸水溶液(0.1%)復(fù)溶，渦旋混勻，12000 r/min離心5 min，取上清液待進樣。
5.4空白試驗
除不加試樣外，按5.2和5.3與試樣同時處理。
5.5儀器參考條件
5.5.1色譜柱：c18(4.6 mm×150 mm，5.0μm)或性能相當者；
5.5.2流動相：a為磷酸水溶液(0.1%)，b為磷酸乙腈溶液(0.1%)，洗脫梯度程序見表1；
5.5.3柱溫：40℃；
5.5.4流速：1.2 ml/min；
5.5.5檢測波長：494 nm；
5.5.6進樣量：10μl。
5.6標準曲線的制作
將標準系列工作液分別注入液相色譜儀中，測定相應(yīng)的峰面積，以標準工作液的濃度為橫坐標，以峰面積響應(yīng)值為縱坐標，繪制標準曲線。胭脂紅酸標準溶液的色譜圖參見附錄a中圖a.1。
5.7試樣溶液的測定
將試樣溶液注入液相色譜儀中，根據(jù)保留時間定性，變化范圍應(yīng)在±2.5%之內(nèi)，峰面積定量，根據(jù)標準曲線得到待測液中胭脂紅酸的濃度。
6分析結(jié)果的表述
試樣中胭脂蟲紅(以胭脂紅酸計)含量按公式(1)計算。
式中：
x——試樣中胭脂蟲紅(以胭脂紅酸計)的含量，單位為克每千克(g/kg)；
c——待測試樣中胭脂蟲紅(以胭脂紅酸計)的濃度，單位為毫克每升(mg/l)；
v——試樣提取液的定容體積，單位為毫升(ml)；
2.00——分取提取液凈化后的定容體積，單位為毫升(ml)；
1 000——換算系數(shù)；
m——試樣的取樣量，單位為克(g)；
25.0——分取提取液的體積，單位為毫升(ml)；
計算結(jié)果保留3位有效數(shù)字。
7精密度
在重復(fù)性條件下獲得的2次獨立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的15 %。
8其他
本方法的檢出限為：當稱樣量為2g時，液體及半固體試樣(含乳半固體除外)中胭脂蟲紅(以胭脂紅酸計)檢出限為0.006g/kg，固體及含乳半固體試樣(調(diào)制乳粉除外)中胭脂蟲紅(以胭脂紅酸計)檢出限為0.01 g/kg，調(diào)制乳粉中胭脂蟲紅(以胭脂紅酸計)檢出限為0.03 g/kg。
本方法的定量限為：當稱樣量為2 g時，液體及半固體試樣(含乳半固體除外)中胭脂蟲紅(以胭脂紅酸計)定量限為0.02g/kg，固體及含乳半固體試樣(調(diào)制乳粉除外)中胭脂蟲紅(以胭脂紅酸計)定量限為0.04 g/kg，調(diào)制乳粉中胭脂蟲紅(以胭脂紅酸計)定量限為0.1 g/kg。