在細(xì)胞培養(yǎng)中，細(xì)胞計(jì)數(shù)是一項(xiàng)基本功，對(duì)于剛剛進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室開(kāi)始做細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的我們來(lái)說(shuō)，讓人頭疼的就是給細(xì)胞計(jì)數(shù)了，雖然比較簡(jiǎn)單，但是經(jīng)常暈頭轉(zhuǎn)向、數(shù)到眼瞎，而且萬(wàn)一一個(gè)不小心被其他人打斷了思路，分分鐘前功盡棄。
其實(shí)，之所以覺(jué)得數(shù)細(xì)胞如此辛苦，很大一部分原因是還沒(méi)有掌握細(xì)胞計(jì)數(shù)的正確操作，當(dāng)儀器對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)分類(lèi)出現(xiàn)異常時(shí)，手工顯微鏡檢查就顯的尤為重要。下面給大家總結(jié)下細(xì)胞計(jì)數(shù)的詳細(xì)步驟的方法，供大家參考。
1，首先準(zhǔn)備好細(xì)胞計(jì)數(shù)器(血球計(jì)數(shù)板)
使用70%乙醇將蓋玻片和細(xì)胞計(jì)數(shù)板清潔、晾干備用。
將晾干的蓋玻片輕輕覆蓋至血細(xì)胞計(jì)數(shù)器上。
(注：使用前須保證蓋玻片和計(jì)數(shù)板已充分晾干，否則將影響后續(xù)細(xì)胞充池及計(jì)數(shù)結(jié)果。)
2，制備細(xì)胞懸液
對(duì)于貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞，我們需要首先使用胰酶消化的方法使細(xì)胞從培養(yǎng)皿表面脫落。(懸浮細(xì)胞則無(wú)需消化，稀釋到合適倍數(shù)即可。)
然后加入適當(dāng)?shù)暮迮囵B(yǎng)基，中和胰酶的作用并重懸細(xì)胞，以得到均質(zhì)的細(xì)胞懸液。要求盡可能將細(xì)胞吹散，不要?dú)埩羧魏渭?xì)胞團(tuán)，但不可用力過(guò)大。
(注：消化太過(guò)或消化不全均會(huì)使計(jì)數(shù)結(jié)果產(chǎn)生偏差。)
臺(tái)盼蘭染色(可選)：
如果需要計(jì)算細(xì)胞的活率，則需要將細(xì)胞懸液和0.4%臺(tái)盼蘭等體積混合;
室溫孵育3-5分鐘(懸浮細(xì)胞染色時(shí)間可視情況適當(dāng)延長(zhǎng))，使臺(tái)盼蘭進(jìn)入死細(xì)胞，使死細(xì)胞著藍(lán)色。
3，血細(xì)胞計(jì)數(shù)器加樣
使用吸管或移液器將細(xì)胞懸液或細(xì)胞/臺(tái)盼蘭混合液滴加到計(jì)數(shù)池的邊緣。此時(shí)液滴將在虹吸的作用下進(jìn)入蓋玻片下方的計(jì)數(shù)池，此即為充池。
(注：若需進(jìn)行多個(gè)樣品的計(jì)數(shù)，應(yīng)盡量保證每次充池的體積一致，一般在10μl/池左右。)
以同樣的方式在另一側(cè)的計(jì)數(shù)池中也加入計(jì)數(shù)樣品。
將計(jì)數(shù)板靜置幾分鐘使細(xì)胞擴(kuò)散、沉降。
4，細(xì)胞計(jì)數(shù)
在100倍顯微鏡下，移動(dòng)計(jì)數(shù)板將視野對(duì)準(zhǔn)計(jì)數(shù)板的中央大方塊，該方塊四周有一圈3條平行線包圍，中間有密集的網(wǎng)格。中央方塊區(qū)差不多剛好可以填滿整個(gè)視野(下圖標(biāo)記的3號(hào)位置)。
分別計(jì)數(shù)大方格1.2.4.5中的細(xì)胞數(shù)。(為降低計(jì)數(shù)誤差，最好將細(xì)胞濃度調(diào)整為20-50個(gè)/大方格。)并重復(fù)記錄另一側(cè)計(jì)數(shù)池中的細(xì)胞數(shù)，總計(jì)8個(gè)大方塊，然后取均值。
計(jì)數(shù)原則為：“數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右”。(判斷標(biāo)準(zhǔn)為是否接觸三條邊線的中間線，如下圖所示)
如果有多個(gè)細(xì)胞沒(méi)有吹散而成團(tuán)存在，此時(shí)只可記為一個(gè)細(xì)胞。如果團(tuán)塊很多，則需重新吹打甚至重新取樣消化直至絕大多數(shù)細(xì)胞為單個(gè)細(xì)胞。
5，細(xì)胞濃度
由上圖可以得出，每個(gè)大方格的容積為：
1 mm2×0.1 mm = 0.1 mm3 =10-4 cm3= 10-4 ml
即每個(gè)大方格的容積為萬(wàn)分之一毫升，因此在計(jì)算每毫升液體中的細(xì)胞數(shù)時(shí)需乘以104。
在常規(guī)沒(méi)有使用臺(tái)盼蘭染色時(shí)，可以以下面公式計(jì)算每毫升樣品中細(xì)胞的個(gè)數(shù)：
每毫升樣品中細(xì)胞的個(gè)數(shù) = 每個(gè)大方格內(nèi)細(xì)胞的平均數(shù) × 細(xì)胞稀釋倍數(shù)×104
如果使用了臺(tái)盼蘭染色，還需要計(jì)算活細(xì)胞的百分率：
活細(xì)胞百分率(%)= 臺(tái)盼蘭拒染細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100
此時(shí)活細(xì)胞數(shù)的計(jì)算公式為：
每毫升樣品中活細(xì)胞的個(gè)數(shù) = 每個(gè)大方格中細(xì)胞的平均數(shù)×活細(xì)胞比率×細(xì)胞稀釋倍數(shù)×2×104
注：乘2是由于在臺(tái)盼蘭染色時(shí)，進(jìn)行了等體積混合，相當(dāng)于稀釋了一倍。
看了以上步驟和原理，大家不禁會(huì)問(wèn)：我們?yōu)槭裁匆獢?shù)細(xì)胞啊?細(xì)胞計(jì)數(shù)究竟有什么意義呢?其實(shí)，當(dāng)我們想了解細(xì)胞的生長(zhǎng)情況時(shí)，除了直接觀察細(xì)胞形態(tài)以外，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線、計(jì)算細(xì)胞倍增時(shí)間應(yīng)該就是廣泛采用的評(píng)價(jià)指標(biāo)了。
所以盡管使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板手工計(jì)數(shù)細(xì)胞過(guò)程十分繁瑣，對(duì)實(shí)驗(yàn)者操作者的要求也比較嚴(yán)格，現(xiàn)在也已有很多自動(dòng)化的細(xì)胞計(jì)數(shù)器/儀，但對(duì)于科學(xué)研究中遇到的各種細(xì)胞而言，手工計(jì)數(shù)仍然是簡(jiǎn)便易行的方法而被廣大實(shí)驗(yàn)室采用。
bio-rad tc20和thermo countess3全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀可以更方便快捷的測(cè)量細(xì)胞數(shù)量